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        新型冠狀病毒疫苗研發進展與挑戰
        2020.04.08

        本文轉自 :中華預防醫學雜志 微信公眾號

        原文鏈接:https://mp.weixin.qq.com/s/aaibrwiFvyGMJWCyix5LeA

        作者:石云1 王寧1 鄒全明2

        單位:1四川大學華西醫院生物制藥研究院,成都 610041;2解放軍陸軍軍醫大學國家免疫生物制品工程技術研究中心,重慶 400038

        封面
        摘要

        新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCoV)感染暴發流行對全球公眾健康構成了嚴重威脅,疫苗接種是有效預防病毒感染流行的手段。2019-nCoV與急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)同屬于β-冠狀病毒?;趯?/span>SARS-CoVMERS-CoV的了解,科學家對2019-nCoV病毒特征的研究、候選抗原及表位的鑒定、動物模型的建立、免疫應答的檢測,疫苗的設計等工作取得了快速的進展。新型冠狀病毒疫苗(新冠疫苗)的研發也取得了快速進展,新冠疫苗類型幾乎涵蓋了目前疫苗研究的所有形式,包括滅活疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗(mRNA疫苗與DNA疫苗)等。至20203月,已有2項新冠疫苗進入了I期臨床試驗,分別為我國軍事醫學科學院聯合天津康希諾生物股份公司研發的基于腺病毒載體的重組新冠疫苗和美國Moderna公司的mRNA 疫苗,兩種疫苗均以2019-nCoV的刺突蛋白為抗原靶標。同時,新冠疫苗研發仍面臨著許多未知的挑戰,如2019-nCoV病毒抗原特征、抗原變異、機體的保護性免疫應答特征以及對老年及基礎病人群是否具有保護,新型疫苗量產的生產工藝等方面仍需要更多的研究。疫苗研發具有其固有規律,在加快速度的同時,保證疫苗的安全性、有效性是必須的前提。

        前言

        新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCoV)感染暴發流行對全球公眾健康構成了嚴重威脅。由2019-nCoV引起的疾病被世界衛生組織(World Health Organization,WHO)正式命名為COVID-19coronavirusdisease 2019)。COVID-19在臨床上表現為肺炎、發燒、咳嗽、肌肉疼痛、疲勞、腹瀉、嚴重時導致死亡。WHO報告顯示,截至2020324日,2019-nCoV已造成世界大流行,確診病例372 757例,其中16 231人死亡[1]。接種疫苗是有效預防病毒感染流行的手段,但是目前尚無新型冠狀病毒疫苗(以下簡稱新冠疫苗)。2019-nCoV2003年暴發的嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)冠狀病毒(SARS-CoV)和2012年暴發的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)冠狀病毒(MERS-CoV)同屬于冠狀病毒科的β-冠狀病毒屬。參照研發SARS-CoVMERS-CoV疫苗的經驗,世界各地科學家正在努力快速研發新冠疫苗。

        正文

        一、新型冠狀病毒疫苗的候選靶標

        冠狀病毒是包膜病毒,主要結構包括單股正鏈核酸(ssRNA)、刺突蛋白 (spike protein,S)、膜蛋白(membrane protein,M)、包膜蛋白 (envelop protein,E)、核衣殼蛋白(nucelocapsid protein,N)。其中,S 蛋白形成三聚體結構,負責識別并結合宿主細胞表面的受體,在病毒感染的第一步發揮重要作用。ME蛋白在病毒裝配中起重要作用,N蛋白是RNA合成所必需的。SARS-CoV的研究顯示,其表面S蛋白直接與宿主細胞表面受體血管緊張素轉換酶2angiotensin converting enzyme 2,ACE2)結合進入細胞引起感染,促進病毒繁殖及發病[2]。S蛋白由S1S2兩個亞基組成,S1亞基的受體結合域(receptorbinding domain, RBD)識別并結合宿主受體,S2亞基的構象變化介導病毒包膜和宿主細胞膜之間的融合。由于2019-nCoVSARS-CoV的基因組的高度相似性,對S蛋白RBD的核酸序列比對分析以及2019-nCoVS蛋白三聚體的冷凍電子顯微鏡結構顯示,ACE2也是2019-nCoV結合的受體[3-6]。阻斷2019-nCoVS蛋白或其RBD與受體的結合可能有助于阻斷病毒侵入細胞,從而防止感染。SARS疫苗的研究結果顯示,針對SAR-CoVS1亞基或S2亞基及RBD的疫苗,對SARS-CoV感染具有一定保護作用[7-8]。提示2019-nCoVS蛋白或RBD可能是疫苗開發的潛在靶標,目前在研的新冠疫苗也主要以S蛋白或其RBD為靶點設計開發。

        冠狀病毒的N蛋白是與病毒RNA結合并構成核衣殼的蛋白,在病毒組裝和 RNA 轉錄中起著至關重要的作用,同時也參與宿主細胞對病毒感染的反應。SARSN蛋白可以和患者血清發生反應,并且表達SARS N蛋白的DNA疫苗也可以誘導小鼠產生抗體反應[9]。但因N蛋白位于病毒顆粒內部,抗體反應可能在抗病毒感染中的作用甚微。另有研究顯示鼻內接種N蛋白的通用T細胞表位的載體疫苗后,可誘導氣道記憶CD4+ T細胞應答,對SARS-CoVMERS-CoV均產生保護反應[10],提示針對N蛋白的通用保守T細胞表位是開發泛冠狀病毒疫苗的潛在策略。

        針對新發的2019-nCoV,利用基因組測序信息和生物信息學手段,研究者快速鑒定出一系列2019-nCoVS蛋白和N蛋白的TB細胞表位[11-12]。值得注意的時,一些BT 細胞表位在2019-nCoV SARS-CoV之間高度保守[13-14],以這些保守的表位序列為靶標而設計的疫苗,可能會對SARS-CoV2019-nCoV產生交叉保護,也可能對病毒持續的變異進化起到保護作用。

        二、新型冠狀病毒疫苗的類型

        WHO統計顯示,全球新冠疫苗研發項目已有50個(截至20203 21[15],幾乎涵蓋了目前疫苗研究的所有形式,滅活疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗(mRNA疫苗與DNA疫苗)等,各疫苗類型的特點、研發機構及研發進展見表1。其中已有2個新冠疫苗進入I期臨床試驗[14],一個是我國軍事醫學科學院聯合天津康希諾生物股份公司研發的基于腺病毒載體的重組新冠疫苗Ad5-nCoV,該疫苗是基于5型復制缺陷型腺病毒作為載體表達2019-nCoVS蛋白的重組疫苗(臨床試驗注冊號:NCT04313127)。另一個是美國國家過敏癥和傳染病研究所聯合Moderna公司研發的 mRNA 疫苗 mRNA-1273,該疫苗為新型脂質納米粒包裹的編碼S蛋白的mRNA (臨床試驗注冊號:NCT04283461)。以腺病毒為載體的疫苗已應用于埃博拉、艾滋病、呼吸道合胞病毒等疫苗的研發。軍事醫學科學院團隊以腺病毒載體技術平臺研發的埃博拉疫苗于2017年獲批上市,可為新冠疫苗的研發及后續疫苗的生產工藝、量產等提供寶貴的經驗?;诖私涷灧e累,Ad5-nCoV被快速開發出來,并報道在動物模型中驗證了有效性。但是也同樣面臨著一些挑戰,如人體對腺病毒載體的預存免疫是否會對疫苗的免疫效果產生干擾,仍需進一步在臨床試驗中觀察闡明。與傳統疫苗相比,mRNA疫苗序列設計靈活,有利于批量制備候選疫苗抗原,且安全性能得到保障,因此mRNA疫苗被認為可以填補常規疫苗在傳染性疾病暴發期的空白[16],但是目前仍未有上市的mRNA疫苗。針對HIV、巨細胞病毒、寨卡病毒、狂犬病毒等的mRNA疫苗已經完成I期臨床試驗[17],巨細胞病毒的mRNA疫苗進入了II期臨床試驗,研究結果顯示其在人體中具有良好的耐受性,并且可以激發有效的T細胞、B細胞應答。然而,mRNA-1273疫苗未見動物實驗中有效性的報道,直接進入臨床試驗,人體內的有效性仍需進一步在臨床試驗中觀察,此外,因為沒有已上市的mRNA疫苗產品,mRNA疫苗的量產、生產工藝無現成經驗借鑒,規?;I生產等也需要進一步摸索[17]。

        新冠
        三、新型冠狀病毒疫苗評價所需的動物模型

        疫苗在上市之前必然要經過嚴格的臨床前試驗,也就是在動物模型中驗證其有效性、安全性。建立可模擬2019-nCoV感染,并引起與人感染類似的疾病特征的動物模型對于疫苗保護效力的評價至關重要。SARS的動物模型研究顯,非人靈長類動物因與人類親緣關系最近,能較好地模擬病毒感染所導致的疾病。中科院武漢病毒所的研究小組發現恒河猴可以感染2019-nCoV,感染2019-nCoV的恒河猴病情相對輕微,沒有發燒癥狀,但肺部X射線檢查顯示出類似人COVID-19的肺炎癥狀[18]。在2019-nCoV感染的恒河猴動物模型上,研究者發現2019-nCoV感染康復后能夠抵抗2019-nCoV的再次感染,在動物實驗上證實了感染后的免疫應答是具有保護性的[19]。但是非人靈長類動物模型由于動物來源有限,研究成本高,難以大量開展,以至由于樣本量受限可能出現缺乏可重復的結果,也不利于疫苗的前期開發研究與評價。

        與非人靈長類動物相比,小型動物模型更具有優勢,易于處理,降低研發成本以及可使用足夠數量進行統計分析。但是對于冠狀病毒,嚙齒動物的易感性各不相同。SARS-CoV的研究顯示普通小鼠(包括BALB/c,C57BL/6129SvEv小鼠)感染SARS-CoV后體內可檢測到病毒的復制,但不引起人類感染的臨床疾病[20]。SARS-CoV感染老年小鼠可觀察到與人感染中觀察到的類似的肺部病理變化[21]。為了能更好地模擬人體SARS-CoV感染的發病狀況,研究者建立了表達人血管緊張素轉換酶2human angiotensin converting enzyme 2 ,hACE2)的轉基因小鼠,轉基因小鼠相比非轉基因小鼠能產生明顯的體重減輕及臨床表現,并最終導致小鼠死亡,因此hACE2轉基因小鼠對評估疫苗的免疫效力具有重要意義[22-23]。北京協和醫學院的團隊在hACE2轉基因小鼠建立了 2019-nCoV感染模型,初步結果報道在BioRxiv預印本上[24],hACE2小鼠感染2019-nCoV后體重減輕,出現較輕微的肺炎的癥狀。

        由于雪貂的肺的生理結構特征與人比較相近,雪貂也是研究流感病毒和其他呼吸到感染較好的模型,在SARS-CoV感染模型建立中仍有一些矛盾的報道[25]。澳大利亞動物健康實驗室初步研究結果顯示雪貂對2019-nCoV易感[26]。這些動物模型的建立將為新冠疫苗的免疫效力評價提供有力的支撐。

        早在2003SARS暴發時期,美國杰克遜實驗室便培育出hACE2轉基因小鼠,但由于SARS的突然消失,相關的研究經費銳減,該實驗室停止了這項研究。SARS-CoV疫情暴發后,杰克遜實驗室迅速恢復了hACE2轉基因小鼠的培育項目,但小鼠擴大繁育仍需要時間才能滿足大量研發工作的需求。同時,沒有一個動物模型是能完美模擬病毒在人體的情況,因此,在應用到人體之前,我們需要在多種動物模型上驗證新冠疫苗的有效性及安全性。

        四、新型冠狀病毒疫苗的免疫保護指標

        目前, 2019-nCoV感染人體后有效的對抗病毒感染的效應細胞和效應分子類型仍不清楚。借鑒SARS-CoVMERS-CoV的研究經驗,有效的疫苗接種后應誘導有效的B細胞應答產生抗體,尤其是中和性抗體,中和抗體可阻止病毒與細胞受體的結合而阻止病毒進入細胞。此外,根據免疫途徑的不同,粘膜途徑接種疫苗還可以激活粘膜分泌型IgA抗體,在感染部位直接對抗病毒感染。

        有效的疫苗還需要激發特異性的、有效的T細胞免疫應答,疫苗激活的特異性的、記憶性CD4CD8 T細胞可在再次接觸病毒時被快速激活,產生細胞因子和/或細胞毒性T淋巴細胞,以對抗病毒的感染。已經證實,T細胞免疫在SARS-CoV感染的恢復中起重要作用[27],并且動物實驗中也證實疫苗特異性記憶CD4 T細胞對SARS-CoV的感染具有保護作用[10]。因此,有效的新冠疫苗應該同時激發中和性抗體及特異性的T細胞應答。

        五、新型冠狀病毒疫苗研發的挑戰

        1.對病毒的認識還需進一步深入,其抗原性質特征等有待進一步研究。目前的疫苗除了滅活疫苗外,其他均以S蛋白作為主要成分,能否提供足夠免疫保護仍需要進一步的研究證實,后續也可以聯合其他候選蛋白多靶點的對抗病毒。此外,病毒的變異速度及其是否會影響抗原性,進而影響疫苗的免疫保護效果?仍不清楚,需要持續監測病毒的變異情況,候選抗原的選擇要考慮包含保守表位;在疫苗評價過程中,同時評價對與疫苗株同源和異源的病毒株的廣泛的免疫保護至關重要。

        2.宿主是如何識別病毒,宿主抗感染的主要免疫效應如何?需加強人群對2019-nCoV感染的免疫反應的監測,明確2019-nCoV感染后患者體內抗體特別是中和性抗體以及T細胞應答的動態變化以及與疾病進程、結局等的關系,為疫苗的設計提供方向性的指導;也有利于建立評估新冠疫苗的免疫反應效力的免疫指標及檢測方法。

        3.疫苗是否會對人群產生廣泛的保護?2019-nCoV感染重癥患者多為老年人或有基礎性疾病的人,這部分人免疫力可能減退,那么疫苗對此部分人群是否有保護作用?為了嚴格評估疫苗,需在老年動物等多種動物模型中對候選疫苗進行保護性評價。

        4.疫苗免疫后的疾病增強現象需要引起關注。病毒感染的抗體依賴性增強(antibody-dependent enhancement,ADE)一直是流行病學,疫苗開發和基于抗體的藥物治療的主要關注點。SARSMERS疫苗的一些研究顯示,動物在免疫后再次暴露于活病毒的情況下,免疫接種的動物可能加重疾病進程[28,29]。在臨床試驗之前,應在動物模型上充分評估疫苗的潛在的增強疾病的風險。

        5.無論研發哪種病毒疫苗,瓶頸除了疫苗設計之外,還有遞送體系的優化,免疫途徑的選擇,以及病毒抗原的生產技術,工藝開發及其可放大都尤為重要。

        六、新型冠狀病毒疫苗研發任重道遠

        疫苗研發過程有其固有規律,制備出新冠疫苗是第一步,后續的臨床前研究還需在動物模型中驗證安全性、有效性;在確保安全有效的情況下才可以申報I、II、Ⅲ期臨床試驗,進而在人體中評價疫苗的安全性和有效性;在完成Ⅲ期臨床試驗充分證實疫苗的安全性、有效性后,這種新疫苗才能申請審批注冊上市;批準后生產過程疫苗質量標準控制,每一步都要嚴格把關。一般來說,一個疫苗研制成功至少需要5~10年時間,甚至更久?;仡?span>SARS2003年暴發)和MERS2012年暴發)疫苗的研究,至今仍然沒有有效的疫苗問世。SARS2項疫苗完成了I期臨床試驗,但是由于SARS的流行結束,缺乏可進行臨床試驗測試的人群,也未見后續的臨床試驗研究。MERS4個疫苗進入了I期臨床試驗,其中一項于2019年完成I期臨床試驗,正在籌備II期臨床試驗。SARSMERS疫苗這些研究經驗提示,疫苗的研發是個漫長而嚴謹的過程。WHO20202月份的聲明中給出了新冠疫苗可能在“18個月及以上”面世,這仍然是最樂觀的估計??茖W、嚴謹的臨床前研究及臨床試驗確保新冠疫苗的安全性和有效性仍然是必不可少的環節,也可能會存在很多不確定因素。此外,17年前,在SARS疫情結束后,企業和政府機構都對SARS疫苗研究失去了興趣和需求,也減少了資助,許多疫苗研究也隨之終止。如果我們現在有SARS疫苗作為戰略儲備,應對2019-nCoV暴發流行可能不會如此被動。

        2019-nCoV疫情暴發的情況下,各國政府在新冠疫苗研發領域的科研經費的大力投入,并且啟動應急疫苗審批。WHO也已建立涉及新冠疫苗研發各個環節的專項小組協調全球科研機構的研發人員通力合作,互通有無,在行政管理上為疫苗的研發一路開“綠燈”。相信有SARSMERS疫苗研發經驗教訓的參考,以及全球科學家的通力合作及各國政府的政策支持,新冠疫苗的研發過程會大大縮短。